主要内容
细菌的转化和筛选
将质粒DNA转移到细菌中。如何选择细菌。蛋白质生产和纯化。
要点:
- 细菌在名为转化的过程中可以获取外来DNA。
- 转化是DNA克隆的关键步骤。它发生在限制酶切消化和连接之后。它将新制造的质粒转移到细菌中。
- 转化之后,细菌在抗生素培养皿上被选择。含有质粒的细菌具有抗药性。每个细菌都将形成菌落。
- 含有正确质粒的菌落可以被培养成由相同细菌组成的大型菌群,用于生产质粒或蛋白。
大局观:DNA克隆
细菌转化和选择是DNA克隆中的关键步骤。DNA克隆是一个制作一个特定DNA片段,例如基因,的多次拷贝的过程。这些拷贝通常在细菌中被制造。
在一个典型的克隆实验中,研究人员首先将DNA的一部分,如基因,插入一个称为质粒的环状DNA。这一步骤使用限制性内切酶和DNA连接酶,被称为连接。
在链接后,下一步是将DNA通过转化转入细菌。然后,我们可以使用抗生素选择和DNA分析方法去识别我们想要的、包含质粒的细菌。
细菌转化和选择的步骤
这里是一种典型的转化和选择细菌的流程:
- 将专门准备的细菌与DNA(例:由连接产生)混合。
- 细菌受到热冲击,这导致它们中的一些会接收质粒。
- 在克隆中使用的质粒含有抗生素抗药性基因。因此,所有细菌都被放在抗生素培养基上,以选择出含有质粒的细菌。
- 没有质粒的细菌死掉。有 质粒的细菌产生一团相同的、含有质粒的细菌,成为菌落。
- 几个菌落被检查去确定一个含有正确质粒的菌落(例:通过PCR或限制性内切酶)。
- 含有正确质粒的菌落被大量培养,被用于生产质粒或蛋白。
为什么我们需要检查菌落?
形成菌落的细菌都应含有(提供抗药性的)质粒。但是,并非所有含质粒的菌落都一定有 一样 的质粒。
这是如何发生的呢?当我们剪切和粘贴DNA时,除我们计划构建的质粒,副产品往往可以形成。例如,当我们试图用特定的内切酶将一个基因插入质粒时,我们可能遇到一些质粒关闭回去(而没有插入基因)的情况,以及一些基因被反向插入的情况。
为什么一个基因反向进入质粒很要紧?在一些情况中,它不要紧。然而,如果我们想要在细菌中表达基因去产生蛋白,基因需要与启动子指向相同方向。如果基因指向反向,错误的DNA链将被转录,不产生蛋白。
细菌中的蛋白质生产
假设我们确定了一个“好的”有质粒的菌落。下一步是什么?所有这些转化、选择和分析的目的是什么?
可能性1: 细菌 = 质粒工厂
在一些情况下,细菌被简单用作“质粒工厂”,产生大量质粒DNA。这些质粒DNA会被用于进一步的DNA克隆步骤(例:如产生更复杂的质粒)或者各种实验。
在其中一些情况下,质粒被直接用于实际目的。例如,在最近对一种遗传性疾病——囊性纤维化患者的基因治疗临床试验中,质粒用于将人类基因传送到肺组织。
可能性2: 细菌 = 蛋白工厂
在其他情况下,细菌可能被用作蛋白工厂。如果质粒含有正确的调控序列,则可以用化学信号去诱导细菌去表达它含有的基因。基因表达导致mRNA的产生,进而被翻译成蛋白。细菌可以被溶解(切开)以释放蛋白。
细菌含有很多蛋白和大分子。因此,新制造的蛋白在能使用前需要被纯化(与其他蛋白和大分子分离)。有很多技术用于蛋白质纯化。
在一种称为亲和层析的技术中,从溶解的细菌中提取的分子混合物被倒入一个柱,即一个充满珠子的圆筒。珠子上涂有抗体,一种免疫系统蛋白,专门与目标分子结合。
柱中的抗体被设计成只与目标蛋白结合,而不与混合物中的其他分子。因此,目标蛋白被困在柱中,而其他分子被冲走。在最后一步中,目标蛋白被从柱中释放并被收集使用。