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主要内容

细菌的转化和筛选

将质粒DNA转移到细菌中。如何选择细菌。蛋白质生产和纯化。

要点:

  • 细菌在名为转化的过程中可以获取外来DNA。
  • 转化是DNA克隆的关键步骤。它发生在限制酶切消化和连接之后。它将新制造的质粒转移到细菌中。
  • 转化之后,细菌在抗生素培养皿上被选择。含有质粒的细菌具有抗药性。每个细菌都将形成菌落
  • 含有正确质粒的菌落可以被培养成由相同细菌组成的大型菌群,用于生产质粒或蛋白。

大局观:DNA克隆

细菌转化和选择是DNA克隆中的关键步骤。DNA克隆是一个制作一个特定DNA片段,例如基因,的多次拷贝的过程。这些拷贝通常在细菌中被制造。
在一个典型的克隆实验中,研究人员首先将DNA的一部分,如基因,插入一个称为质粒的环状DNA。这一步骤使用限制性内切酶和DNA连接酶,被称为连接
在链接后,下一步是将DNA通过转化转入细菌。然后,我们可以使用抗生素选择和DNA分析方法去识别我们想要的、包含质粒的细菌。

细菌转化和选择的步骤

这里是一种典型的转化和选择细菌的流程:
  1. 将专门准备的细菌与DNA(例:由连接产生)混合。
  2. 细菌受到热冲击,这“鼓励”它们去接收质粒。大多细菌不接收质粒,但有一些会。
  3. 在克隆中使用的质粒含有抗生素抗药性基因。因此,所有细菌都被放在抗生素培养基上,以选择出含有质粒的细菌。
  4. 没有质粒的细菌会死掉。每个 质粒的细菌会产生一团相同的、含有质粒的细菌,称为菌落。一个典型的菌落看起来像发白的、针头大小的小点。
  5. 一些菌落被检查已确定一个含有正确质粒的菌落。
  6. 含有正确质粒的菌落被大量培养,被用于生产质粒或蛋白。
  1. 将专门准备的细菌与DNA(例:由连接产生)混合。
  2. 细菌受到热冲击,这导致它们中的一些会接收质粒。
  3. 在克隆中使用的质粒含有抗生素抗药性基因。因此,所有细菌都被放在抗生素培养基上,以选择出含有质粒的细菌。
质粒的图。这个质粒含有一个抗生素抗药性基因,一个驱动细菌基因表达的启动子,和一个通过连接插入的目标基因。
  1. 没有质粒的细菌死掉。 质粒的细菌产生一团相同的、含有质粒的细菌,成为菌落
  2. 几个菌落被检查去确定一个含有正确质粒的菌落(例:通过PCR或限制性内切酶)。
  3. 含有正确质粒的菌落被大量培养,被用于生产质粒或蛋白。

为什么我们需要检查菌落?

形成菌落的细菌都应含有(提供抗药性的)质粒。但是,并非所有含质粒的菌落都一定有 一样 的质粒。
这是如何发生的呢?当我们剪切和粘贴DNA时,除我们计划构建的质粒,副产品往往可以形成。例如,当我们试图用特定的内切酶将一个基因插入质粒时,我们可能遇到一些质粒关闭回去(而没有插入基因)的情况,以及一些基因被反向插入的情况。
左:基因正向插入质粒(与启动子指向相同)。这是来自连接所需的质粒。
中:质粒关闭但没有接收基因。这不是一个有用的质粒。
右:基因被反向插入质粒(与启动子指向相反)。如果我们想要在细菌中表达基因,这不是一个有用的质粒。
为什么一个基因反向进入质粒很要紧?在一些情况中,它不要紧。然而,如果我们想要在细菌中表达基因去产生蛋白,基因需要与启动子指向相同方向。如果基因指向反向,错误的DNA链将被转录,不产生蛋白。
因为这些可能性,从每个菌落提取质粒DNA、并检查其是否与我们试图构造的质粒一致就很重要。为了分析来自细菌菌落的质粒DNA,限制性内切酶、PCR、以及DNA测序十分常用。

细菌中的蛋白质生产

假设我们确定了一个“好的”有质粒的菌落。下一步是什么?所有这些转化、选择和分析的目的是什么?

可能性1: 细菌 = 质粒工厂

在一些情况下,细菌被简单用作“质粒工厂”,产生大量质粒DNA。这些质粒DNA会被用于进一步的DNA克隆步骤(例:如产生更复杂的质粒)或者各种实验。
在其中一些情况下,质粒被直接用于实际目的。例如,在最近对一种遗传性疾病——囊性纤维化患者的基因治疗临床试验中,质粒用于将人类基因传送到肺组织。

可能性2: 细菌 = 蛋白工厂

在其他情况下,细菌可能被用作蛋白工厂。如果质粒含有正确的调控序列,则可以用化学信号去诱导细菌去表达它含有的基因。基因表达导致mRNA的产生,进而被翻译成蛋白。细菌可以被溶解(切开)以释放蛋白。
一个被选择的菌落被培养成大菌群。通过向培养介质中添加化学信号,菌群中的细菌被诱导表达目标基因。在每个细菌中,目标基因被转录成mRNA,mRNA再被翻译成蛋白。目标基因编码的蛋白在细菌内积累。
细菌含有很多蛋白和大分子。因此,新制造的蛋白在能使用前需要被纯化(与其他蛋白和大分子分离)。有很多技术用于蛋白质纯化。
产生蛋白的细胞被涨破(溶解),释放出蛋白和其他细胞内容物。从细胞里提取出来的分子被加入到含有目标蛋白特异性抗体的柱中。因此,蛋白被困在种种而其他分子会流出。在最后一步中,在所有非目标蛋白被冲走后,目标蛋白从柱中抗体上被释放,纯的蛋白被收集使用。
在一种称为亲和层析的技术中,从溶解的细菌中提取的分子混合物被倒入一个,即一个充满珠子的圆筒。珠子上涂有抗体,一种免疫系统蛋白,专门与目标分子结合。
柱中的抗体被设计成只与目标蛋白结合,而不与混合物中的其他分子。因此,目标蛋白被困在柱中,而其他分子被冲走。在最后一步中,目标蛋白被从柱中释放并被收集使用。

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