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主要内容

限制性内切酶和DNA连接酶

限制消化。粘性末端和钝性末端。连接反应。

要点:

  • 限制性内切酶是DNA切割酶, 识别一个或几个目标序列, 并在这些序列或附近切割 DNA。
  • 很多限制性内切酶切割出不整齐的碎片,有单链的DNA末端。然而,有些产生整齐的末端。
  • DNA 连接酶 是连接DNA的酶。如果两段DNA片段有匹配的末端,连接酶可以将他们连接成一个完整的DNA。
  • 在 DNA 克隆中,限制性内切酶和DNA连接酶被用于将DNA的基因和其他片段插入质粒中。

你怎么切割和粘贴DNA?

DNA 克隆, 研究人员将制作多个DNA片段,比如一段基因。多数情况下,克隆需要将基因插入一段环状DNA质粒中,可以在细菌中被复制。
来自不同物种的DNA片段如何被连接到一起形成一个DNA分子呢?有一个利用限制性内切酶和DNA连接酶的方法。
  • 限制性内切酶 是一种DNA-切割酶,它辨认DNA中的具体位置。许多限制性内切酶在其识别位置或附近进行不整齐削减,生产有暴露的单链的末端。
  • 如果两个DNA分子有匹配的末端,它们可以被DNA连接酶连接。DNA连接酶将分子间隙密封,形成一个DNA分子。
限制性内切酶和DNA连接酶通常将基因和其他DNA片段插入质粒中。

限制性内切酶

限制性内切酶出现在细菌(和其他原核生物中)。它们辨认并结合到名为 限制性位置 的 DNA 特定序列。每个限制性内切酶只辨认一个或几个限制性位置。当它找到目标序列时,限制性内切酶将使DNA分子双链切割。通常,切割是在限制性位置或附近,并且是可预测的切割。
作为限制性酶如何辨认和切割DNA序列的例子,让我们考虑EcoRI,这是通常实验室使用的限制性内切酶。EcoRI在下列位置切割:
5'-...GAATTC...-3' 3'-...CTTAAG...-5'
EcoRI 位点
当EcoRI辨认和切割这些位置时,切割的规律是固定的并产生“裸露的”单链DNA:
一个EcoRI酶与一个EcoRI位点在一段DNA中结合并在两段DNA上都有切割。切割规律:
5'-...G|AATTC...-3' 3'-...CTTAA|G...-5'
因此,他们在两段都产生5'-AATT-3'暴露片段。
如果另一块DNA有匹配的片段(例如,其也被EcoRI切割了),这些暴露片段可以通过碱基互补与其他片段结合。为此,留下单一暴露片段的酶被称作 粘性片段。粘性片段有助于克隆,因为它们将两个DNA片段靠近以被DNA连接酶连接。
并非所有限制性内切酶都产生粘性片段。有些是“整齐切割”,直接在片段中间一切到底并不留下暴露片段。限制性内切酶Sma就是使用整齐切割:
一个SmaI酶与SmaI限制性位点连接,是:
5'-...CCCGGG...-3' 3'-...GGGCCC...5'
在两个序列片段中间横切一刀,产生两个整齐片段。切割位点是:
5'-...CCC|GGG...-3' 3'-...GGG|CCC...5'
整齐切割的片段可以被DNA连接酶结合到其他片段。然而,整齐片段更难被连接到一起(连接反应容易失败)由于没有暴露单链将DNA分子固定。

DNA连接酶

如果你知道DNA 复制,你可能已经看到过DNA连接酶。在DNA复制中,连接酶的工作就是合并新合成的DNA碎片,形成一个无缝的DNA链。DNA克隆中的连接酶基本上做了同样的事。如果两个DNA末端匹配,DNA连接酶可以与其合并,变成不可分割的分子。
DNA的碎片1:
5'-...G 3'-...CTTAA
DNA的碎片 2:
AATTC...-3' G...-5'
两个分子的单链DNA区域可以通过氢键连接,但骨架中还有间隙:
5'-...G|AATTC...-3' 3'-...CTTAA|G...-5'
DNA连接酶将缝隙密合,使它成为一个不可分离的DNA分子:
5'-...GAATTC...-3' 3'-...CTTAAG...-5'
DNA连接酶如何做到这个?它使用ATP作为能量来源,通过连接酶催化反应使5’ 端的磷基与3’端的羟基结合。这种反应生成紧密的糖-磷骨架。

示例:构建一个重组质粒

我们来看一看限制性酶切和连接如何将基因插入到质粒中。假设我们有一个靶基因,两侧有EcoRI 辨认位点,和一个质粒,有单个EcoRI位点。
我们开始使用目标基因和环状质粒。目标基因在末端附近有两个EcoRI 识别位点。质粒在其中有一个EcoRI 位点,就在表达细菌的启动子后面。EcoRI位点的序列是:
5'-GAATTC-3' 3'-CTTAAG-5'
我们的目标是用酶EcoRI将基因插入质粒。首先,我们分别用EcoRI消化(切割)基因片段和质粒。这一过程产生有粘性末端的片段:
我们单独消化(切割)基因碎片以及EcoRI质粒。这一步骤产生了粘性片段。所有末端有四个核苷酸组成的末端,序列5'-AATT-3'。由于EcoRI切割顺序是:
5'-G|AATTC-3' 3'-CTTAA|G-5'
其次,我们把基因片段和切割后的(被打开的)质粒结合起来,并使用DNA连接酶将它们结合。这两个片段的粘性片段通过碱基互补配对:
其次,我们把基因片段和切割后的(被打开的)质粒结合起来,并使用DNA连接酶将它们结合。这两片段的粘性片段通过碱基互补配对。然而,DNA双螺旋的糖-磷骨架间在基因和质粒DNA相接处依然有间隙。
一旦它们被连接酶结合,碎片就会成为一个不可分割的DNA分子。目标基因现已被插入质粒,从而产生了重组质粒。
一旦这些碎片被连接酶聚集,碎片就会成为一个DNA分子。目标基因现已被插入质粒,从而产生了重组质粒。在质粒中,基因现在两端有由切割又连接产生的EcoRI 位点。

限制性切割和连接有许多DNA分子参与

在上述例子中,我们看到了一种基因与质粒被EcoRI切割的结果。但是,这种过程也可能有其他结果。例如,切割后的质粒可以在没有基因的情况下重新成为环状。同样的,基因也可以反着插入质粒(由于两个EcoRI粘性末端是一样的)。
左:重组质粒在前进(“指向“远离启动子的方向)方向的重组质粒。
中:非重组基因由切割后就重新连成环的质粒组成(自己与自己连接)。
右:基因向回方向(指向启动子的方向)行进时的重组质粒。
限制性消化和连接可以像这样生成很多质粒的拷贝和DNA基因。事实上,在单个连接中会用到数十亿的DNA分子。这些分子与DNA连接酶随机地互相碰撞。因此,如果多个生成物产生,全部都 是某种特定频率 – 有些不是我们想要的。
我们怎样避免“坏”质粒呢?当我们用连接酶转化细菌 和DNA时,每个接受一个不同的DNA片段。我们在转化后检查并只用有正确质粒的细菌。很多时候,转化后细菌的质粒通过另一种限制性消化判断其是否含有正确方向且正确插入的质粒。

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