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主要内容

凝胶电泳

一种根据大小和电荷来分离DNA片断和其他大分子的技术。

要点:

  • 凝胶电泳是一种用于根据DNA分子大小来分离DNA片段的技术。
  • DNA样本被放入凝胶一端的井(凹痕)中,并施加电流拉它们穿过凝胶。
  • DNA片段带负电,因此它们会向正电极移动。 因为所有DNA片段单位质量所带电荷量是相同的,所以小片段比大片段更快地穿过凝胶。
  • 当DNA结合染料把凝胶染色时,可见DNA片段呈带状分布,每条带子表示一组相同大小的DNA片段。

介绍

假设你刚完成一项 PCR 反应, 复制了许多目标DNA区域。 或者可能你做了一些 DNA 复制, 试图将一个基因“粘贴”到一个圆形的DNA质粒中。
现在,你要检查一下你的PCR反应是否有效,或者你的质粒中是否有正确的基因。你能采用什么技术来可视化(直接观察)DNA片段?

凝胶电泳

凝胶电泳是一种基于DNA分子的大小和电荷来分离DNA片段(或其他大分子,如RNA和蛋白质)的技术。电泳要让电流流过含有目标分子的凝胶。根据它们的尺寸和电荷,分子们会以不同的方向或以不同的速度在凝胶中移动,从而使它们彼此分离。
所有的DNA分子单位质量所带的电荷量都是相通的。因此,DNA片段的凝胶电泳仅根据尺寸来分离它们。使用电泳,我们可以看到一个样本中存在多少不同的DNA片段,以及它们之间的相对大小。我们也可以在由已知大小的DNA片段组成的标准“标尺”的旁边检查它,以此来确定一段DNA的绝对大小。

什么是凝胶?

顾名思义,凝胶电泳要用到凝胶:一块像果冻一样的材料。用于DNA分离的凝胶通常由一种称为琼脂糖的多糖制成,这种多糖以干燥的粉状薄片的形式存在。当琼脂糖在缓冲液(含盐的水)中被加热并使其冷却时,它会形成固体的、略带糊状的凝胶。在分子水平上,凝胶是琼脂糖分子的基质,它们被氢键结合在一起并形成微小的孔。
在一端,凝胶具有称为 的口袋状凹槽,这些凹槽是放置DNA样品的地方:
在加入DNA样品之前,必须将凝胶置于凝胶盒中。 盒子的一端钩在正极上,而另一端钩在负极上。 放置凝胶的盒子的主体填充有可以导电的含盐缓冲溶液。 虽然你可能无法在上图中看到(多亏了我惊人的艺术技巧),缓冲液将凝胶盒填充到刚好能覆盖凝胶的水平。
把凝胶带有井的一端朝着负电极放置。 没有井的一端(DNA片段将向这里迁移)朝着正电极放置。

DNA片段如何通过凝胶?

凝胶放入盒子之后,把每个要检测的DNA样本(例如,每个PCR反应或每个酶切鉴定(restriction-digested)了的质粒)小心地移入一个井中。 一个井留作 DNA 梯,一个包含已知长度的DNA片段的标准参照物。 商用DNA梯具有不同的尺度范围,因此我们要选择一个能够很好地“覆盖”我们的预期片段的尺寸的DNA梯。
下一步,打开连接到凝胶盒子的电源,这时电流开始流过凝胶。DNA分子因为它们的糖磷酸主干上的磷酸基团而带负电,所以他们开始在凝胶矩阵中朝着正极移动。当电源打开,电流通过凝胶时,我们说凝胶在
DNA样本被加入到凝胶靠近负电极一端的井中。
电源开启,DNA片段在凝胶中迁移(朝着正电极)。
在凝胶跑过之后,片段按大小被分离。最大的片段靠近凝胶上端(负电极,它们的起始位置),而最小的片段在靠近下端的位置(正电极)。
此图基于Reece et al中相似的图。2
凝胶在跑的时候,短的DNA片会以比长的片更快的速度穿过凝胶矩阵的毛孔。在凝胶跑了一会儿之后,最短的DNA片会在靠近凝胶正极的位置,而最长的DNA片会留在靠近井的位置。如果我们开着电源太长时间,那些非常短的DNA片可能已经直接跑过了凝胶的尽头(这无疑是件已经让我非常后悔的事情)。

DNA片段的可视化

片段被分离之后,我们就可以去查看凝胶上有哪些尺寸的带子。当凝胶被DNA结合染料染色并被紫外线照射时,DNA片段会发出荧光,这样我们就能看见沿着凝胶出现在不同位置的DNA。
梯中每个数字旁边的 bp 表示DNA片段的长度是多少个 碱基对
凝胶上一条清晰的DNA“线”称为一条。每条带都包含着大量的成组移动到相同位置的同样大小的DNA片段。独自出现的单个DNA片段(甚至一小群DNA片段)在凝胶中是看不见的。
通过把一个样本中的带和DNA梯进行比较,我们就可以去顶它们大概的尺寸。比如,上图中凝胶上的亮带尺寸大约是700个碱基对(bp)。

练习

最左边的道:DNA梯,上面标有3000 bp、1500 bp和500 bp的带。
1号道:5000 bp的带。
2号道:100 bp的带。
3号道:1500 bp和2000 bp的带。
4号道:500 bp的带。
上图中有四条标了号的道。(一条 就是DNA离开井之后走过的一条通道。)
哪条道满足下面所有描述?
1
2
3
4
这条道包含最长的DNA片段。
这条道包含最短的DNA片段。
这条道包含一组长度为1500碱基对(bp)的DNA片段。

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