主要内容
凝胶电泳
一种根据大小和电荷来分离DNA片断和其他大分子的技术。
要点:
- 凝胶电泳是一种用于根据DNA分子大小来分离DNA片段的技术。
- DNA样本被放入凝胶一端的井(凹痕)中,并施加电流拉它们穿过凝胶。
- DNA片段带负电,因此它们会向正电极移动。 因为所有DNA片段单位质量所带电荷量是相同的,所以小片段比大片段更快地穿过凝胶。
- 当DNA结合染料把凝胶染色时,可见DNA片段呈带状分布,每条带子表示一组相同大小的DNA片段。
凝胶电泳
凝胶电泳是一种基于DNA分子的大小和电荷来分离DNA片段(或其他大分子,如RNA和蛋白质)的技术。电泳要让电流流过含有目标分子的凝胶。根据它们的尺寸和电荷,分子们会以不同的方向或以不同的速度在凝胶中移动,从而使它们彼此分离。
所有的DNA分子单位质量所带的电荷量都是相通的。因此,DNA片段的凝胶电泳仅根据尺寸来分离它们。使用电泳,我们可以看到一个样本中存在多少不同的DNA片段,以及它们之间的相对大小。我们也可以在由已知大小的DNA片段组成的标准“标尺”的旁边检查它,以此来确定一段DNA的绝对大小。
什么是凝胶?
顾名思义,凝胶电泳要用到凝胶:一块像果冻一样的材料。用于DNA分离的凝胶通常由一种称为琼脂糖的多糖制成,这种多糖以干燥的粉状薄片的形式存在。当琼脂糖在缓冲液(含盐的水)中被加热并使其冷却时,它会形成固体的、略带糊状的凝胶。在分子水平上,凝胶是琼脂糖分子的基质,它们被氢键结合在一起并形成微小的孔。
在一端,凝胶具有称为 井 的口袋状凹槽,这些凹槽是放置DNA样品的地方:
在加入DNA样品之前,必须将凝胶置于凝胶盒中。 盒子的一端钩在正极上,而另一端钩在负极上。 放置凝胶的盒子的主体填充有可以导电的含盐缓冲溶液。 虽然你可能无法在上图中看到(多亏了我惊人的艺术技巧),缓冲液将凝胶盒填充到刚好能覆盖凝胶的水平。
把凝胶带有井的一端朝着负电极放置。 没有井的一端(DNA片段将向这里迁移)朝着正电极放置。
DNA片段如何通过凝胶?
凝胶放入盒子之后,把每个要检测的DNA样本(例如,每个PCR反应或每个酶切鉴定(restriction-digested)了的质粒)小心地移入一个井中。 一个井留作 DNA 梯,一个包含已知长度的DNA片段的标准参照物。 商用DNA梯具有不同的尺度范围,因此我们要选择一个能够很好地“覆盖”我们的预期片段的尺寸的DNA梯。
下一步,打开连接到凝胶盒子的电源,这时电流开始流过凝胶。DNA分子因为它们的糖磷酸主干上的磷酸基团而带负电,所以他们开始在凝胶矩阵中朝着正极移动。当电源打开,电流通过凝胶时,我们说凝胶在跑。
凝胶在跑的时候,短的DNA片会以比长的片更快的速度穿过凝胶矩阵的毛孔。在凝胶跑了一会儿之后,最短的DNA片会在靠近凝胶正极的位置,而最长的DNA片会留在靠近井的位置。如果我们开着电源太长时间,那些非常短的DNA片可能已经直接跑过了凝胶的尽头(这无疑是件已经让我非常后悔的事情)。
DNA片段的可视化
片段被分离之后,我们就可以去查看凝胶上有哪些尺寸的带子。当凝胶被DNA结合染料染色并被紫外线照射时,DNA片段会发出荧光,这样我们就能看见沿着凝胶出现在不同位置的DNA。
凝胶上一条清晰的DNA“线”称为一条带。每条带都包含着大量的成组移动到相同位置的同样大小的DNA片段。独自出现的单个DNA片段(甚至一小群DNA片段)在凝胶中是看不见的。
通过把一个样本中的带和DNA梯进行比较,我们就可以去顶它们大概的尺寸。比如,上图中凝胶上的亮带尺寸大约是 个碱基对(bp)。
练习
上图中有四条标了号的道。(一条 道 就是DNA离开井之后走过的一条通道。)
哪条道满足下面所有描述?